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TUNEL is a method for detecting apoptotic DNA fragmentation, widely used to identify and quantify apoptotic cells, or to detect excessive DNA breakage in individual cells. The assay relies on the use of terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT), an enzyme that catalyzes attachment of deoxynucleotides, tagged with a fluorochrome or ...
- Fixierung
- Permeabilisierung
- Start Der Tunel-Reaktion
- Abstoppen Der Tunel-Reaktion
- Analyse
Das zu untersuchende Gewebe muss zunächst fixiert werden, um die biologisch relevanten Strukturen zu erhalten. Dies geschieht durch Eintauchen des Gewebepräparats in eine Fixierlösung, wodurch die intrazellulären Proteine durch Crosslinkingfixiert werden. Das fixierte Gewebe wird anschließend in ca. 10 µmdünne Scheiben geschnitten.
Die Permeabilisierungermöglicht das Vordringen des TUNEL-Reagenz (bestehend aus tdT und fluoreszenzmarkierten dUTPs) in den Zellkern.
Das TUNEL-Reagenz wird hinzugefügt und der Reaktionsansatz bei 37 °C für 1 bis 3 Stunden inkubiert. Die TUNEL-Reaktion benötigt Cobalt als Cofaktor, dieses befindet sich in der Pufferlösung. Der Reaktionsansatz muss vor Licht geschützt werden, damit der Fluoreszenzfarbstoff nicht ausbleicht.
Nach Ablauf der TUNEL-Reaktion wird diese durch Hinzugabe eines Stopp-Puffers abgebrochen.Es folgt eine kurze Inkubation, bevor der Ansatz mit phosphatgepufferter Salzlösunggewaschen wird.
Die TUNEL-positiven Zellen werden unter dem Fluoreszenzmikroskop detektiert, gezählt und ihr prozentualer Anteil bestimmt. Darüber wird das Ausmaß der Apoptose im untersuchten Gewebe quantifiziert.
Learn how to perform TUNEL staining (or TUNEL assay), a technique to detect DNA breaks in apoptosis, using different methods and kits. Compare the advantages and disadvantages of each method and see examples of TUNEL staining results.
Learn about the TUNEL assay, a technique to detect apoptosis by labeling DNA breaks with fluorescent nucleotides. Find chapters and articles on methods, applications, and limitations of TUNEL assay in neuroscience and pathobiology.
Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) dUTP Nick-End Labeling (TUNEL) assay has been designed to detect apoptotic cells that undergo extensive DNA degradation during the late stages of apoptosis. The method is based on the ability of TdT to label blunt ends of double-stranded DNA breaks independent of a template.
- Kateryna Kyrylkova, Sergiy Kyryachenko, Mark Leid, Chrissa Kioussi
- 2012
2. Jan. 2021 · Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick-end labeling (TUNEL) assay is a long-established assay used to detect cell death-associated DNA fragmentation (3’-OH DNA termini) by endonucleases.
3. März 2022 · We used TUNEL assay in Drosophila melanogaster third-instar larval eye-antennal imaginal discs to label and quantify cell death. This assay is sensitive to detect DNA fragmentation, an important event, during apoptosis in retinal neurons.
